Como escolher sua Transcriptase Reversa
Existem vários tipos de transcriptases reversas (RTs). Para escolher a transcriptase reversa ideal para o seu experimento, é importante conhecer suas propriedades enzimáticas, levando em conta fatores como: o comprimento do RNA alvo, a presença de uma estrutura secundária complexa do RNA, a aplicação que será dada ao RNA, o CDNA, e o nível de atividade da enzima RNase H.
As duas RTs mais usadas normalmente são a AMV-RT (Transcriptase Reversa do Vírus da Mieloblastose Aviária) e a M-MLV-RT (Transcriptase Reversa do Vírus da Leucemia Murina de Moloney). Vamos observar as características de cada uma delas a seguir:
1. AMV-RT (Transcriptase Reversa do Vírus da Mieloblastose Aviária)
A temperatura ótima de atividade da AMV-RT está entre 42 e 48 ° C, mas é possível trabalhar entre 25 e 58 ° C. A vantagem de trabalhar em temperaturas mais altas é poder desnaturar as regiões secundárias fortes ou ricas em GC. O AMV é compatível, como todas as RTs, com iniciadores específicos para o gene, oligoDT ou mesmo iniciadores aleatórios. No entanto, o uso de hexâmeros aleatórios requer uma temperatura de reação reduzida para 37 °C.
A realização de testes em alta temperatura resolve o problema de estruturas secundárias, mas às custas da integridade do RNA. O RNA, sendo termolábil, é sensível à degradação. Normalmente a hidrólise do RNA é baixa, mas isso pode aumentar dependendo do pH, da alta temperatura e da presença de cátions divalentes. Para sintetizar cDNA de RNA longo é recomendável não trabalhar em temperaturas muito altas. Para minimizar o tempo em que o RNA é exposto a altas temperaturas, é aconselhável incorporar uma etapa inicial de desnaturação, na qual o RNA e o primer são combinados, aquecidos brevemente para ajudar a desnaturar quaisquer estruturas secundárias, e depois esfriar rapidamente no gelo para manter o estado desnaturado. RT, tampão de reação e dNTPs são então adicionados e a reação é incubada à temperatura desejada.
A AMV-RT possui uma atividade intrínseca da RNase-H que degrada a cadeia de RNA do híbrido RNA / DNA e que pode cortar o RNA se a enzima parar durante a síntese. Isso reduz o rendimento total de cDNAs obtidos, bem como a porcentagem de cDNAs inteiros, limitando assim a utilidade do AMV para a transcrição reversa de RNAs maiores que 5kb.
Sendo a AMV-RT mais processivo que a M-MLV-RT, é necessário menos unidades para gerar a mesma quantidade de cDNA: 25 unidades de AMV-RT equivalem a aproximadamente 200 unidades de M-MLV-RT. Estas enzimas inibidoras da Taq Polimerase devem ser inativadas antes da etapa de PCR por aquecimento a 70 ou 100 ° C seguido por 5 min em gelo.
Portanto, a AMV-RT é recomendada para RT-PCR em 1 ou 2 etapas, para transcrição reversa de RNA <5kb e extensão de iniciadores, em particular se o RNA tiver uma estrutura secundária forte.
2. M-MLV-RT (Transcriptase Reversa do Vírus da Leucemia Murina de Moloney)
A M-MLV-RT é frequentemente utilizada para a transcrição reversa de RNA > 5 kb por sua atividade de RNAse H inferior. No entanto, sua baixa temperatura ótima de atividade, em torno de 37 °C, a torna menos eficaz no caso de estruturas secundárias fortes. Contudo, existem variações de que são populares devido à falta de atividade da RNase H e a temperaturas de reação mais altas. A variante mais popular é o mutante do ponto H M-MLV RT RNase mutante, que pode ser usada em temperaturas de até 55 °C, tornando o ponto H do mutante M-MLV RT RNase H adequado para RNAs com estruturas secundárias fortes.
Por outro lado, na ausência de estruturas secundárias, trabalhar em temperaturas mais baixas torna possível ter cDNAs mais longos.
Assim, a ausência de atividade da RNase H faz com que o mutante M-MLV RT RNase H- aponte a enzima de escolha para a transcrição reversa de RNAs longos para a construção de bibliotecas de cDNA, a geração de sondas d CDNA e extensão de iniciadores.
Conclusão
Para escolher a transcriptase reversa certa para a sua síntese de cDNA e projeto de RT-PCR, faça as seguintes perguntas a você mesmo:
- Você trabalha com um modelo que possui estruturas secundárias altas?
A AMV-RT é a transcriptase reversa ideal para modelos com uma estrutura secundária alta, devido à sua estabilidade em temperaturas de reação mais altas (37-58 ° C).
- Você realiza RT-PCR rotineiramente e, portanto, procura uma RT que seja econômica?
A MMLV-H Minus (M-MLV RT [H-]), Point Mutant, é uma transcriptase reversa que pode ser usada na síntese de cDNA durante a RT-PCR e que funciona muito bem com transcritos longos.
- Você vai realizar RT-qPCR, trabalhar em alvos raros ou muito longos ou com RNA que possa conter contaminantes inibidores da PCR?
Nesse caso, escolha a transcriptase reversa GoScript™. Ela usa M-MLV-RT e buffers projetados especificamente para RT-qPCR para fornecer síntese robusta e confiável de cDNA, mesmo na presença de inibidores.
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