Conheça os tipos de testes mais usados para medir a viabilidade celular. 

Como sabemos, existem múltiplas técnicas para se medir a viabilidade celular. Para ter uma visão geral, este artigo propõe uma revisão dos principais métodos. Para cada um deles, vamos explicar o procedimento e suas respectivas vantagens e desvantagens.

Quais métodos são mais usados para medir viabilidade celular?

Para análises de alto throughput (alto rendimento), um dos métodos mais utilizados é a mensuração de ATP (adenosina trifosfato) intracelular. Essa medição pode ser feita usando ensaios bioluminescentes. A luciferase, na presença do seu substrato, a luciferina, e de ATP, um co-fator da reação, produz luz, que pode ser medida com um luminômetro. A quantidade de luz emitida é diretamente proporcional à quantidade de ATP, e portanto ao número de células vivas da amostra. Esta técnica altamente sensível se adapta perfeitamente a testes em microplaca para rendimentos altos e muitos altos.

Vários outros métodos mais antigos se baseiam no uso de um reagente que é transformado pelas células vivas, ao longo de um período de incubação, num subproduto colorido (ensaio colorimétrico) ou fluorescente. Então, a absorbância ou fluorescência deste produto é medida usando um leitor. O sinal é diretamente proporcional ao número de células vivas, porque as células mortas perdem sua capacidade de transformar esse reagente. 

Muitos testes de viabilidade usam esse princípio, como a redução de um componente do tetrazólio (ex: MTT ou MTS) ou a medição da atividade de "proteases de células vivas". Esses testes são, no entanto, menos sensíveis que os métodos bioluminescentes e podem ser usados principalmente para aplicações de menor fluxo. 

1. Viabilidade Celular em Tempo Real

Você sabia que é possível medir a viabilidade celular em tempo real, sem lise celular? A Promega desenvolveu um teste de viabilidade em tempo real que utiliza uma luciferase e um pré-substrato (luciferina modificada). Estes reagentes são adicionados diretamente ao meio de cultura celular. O pré-substrato que penetra nas células vivas é transformado, por redução, em um novo substrato. Esse novo substrato sai da célula e reage com a luciferase, emitindo luz. É possível realizar medições no mesmo teste por até 3 dias e, assim, determinar a resposta à dose de um medicamento, por exemplo. Esta abordagem requer poucas células, reduz o número de placas, e não provoca a lise celular, possibilitando assim que sejam feitos outros testes ou aplicações em seguida, com o mesmo ensaio.

Produto Promega: RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay (Código: G9711)

 

2. Medição de ATP

Somente células vivas são capazes de sintetizar ATP. É possível medir essa quantidade de ATP por um teste bioluminescente, adicionando um tampão de lise ao meio de cultura, que liberará o ATP intracelular, uma luciferase estabilizada e seu substrato, luciferina. Na presença de ATP, a luciferase usará luciferina e produzirá luz. Esse teste “ATPmétrico”, realizado em 12 minutos, é rápido porque não requer um longo período de incubação. Além disso, é muito sensível, possui uma ampla faixa dinâmica que a torna utilizável para banda larga e reduz o risco de artefatos, diferentemente de outras técnicas.

Produtos Promega: CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Código: G7570), CellTiter-Glo® 2.0 Assay (Código: G9241)

 

3. Testes de protease de marcador de viabilidade

A atividade de certas proteases desaparece rapidamente após a morte celular e, portanto, pode ser usada como um marcador para células vivas. Este método de medição envolve o uso de um substrato fluorogênico que após a entrada nas células (GF-AFC) é clivado por essas proteases ativas, produzindo um sinal fluorescente proporcional ao número de células vivas. Comparado aos métodos baseados na redução do tetrazólio (citado abaixo), esse teste é mais rápido com um período de incubação reduzido a 0,5-1H e é não lítico, oferecendo a possibilidade de multiplexação com outros testes, como outros testes com células bioluminescentes.

Produto Promega: CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay (Código: G6080)

 

4. Redução de tetrazólio

O princípio desses testes é determinar a viabilidade celular com base na capacidade das células de reduzir um corante de tetrazólio pela ação da enzima, a NAD (P) oxidoredutase celular dependente de H, presente em células viáveis.

Os compostos de tetrazólio utilizados se enquadram em duas categorias principais:

1) Compostos carregados positivamente (como MTT) que entram facilmente na célula. Este último é reduzido e convertido em formazan, de cor púrpura, apenas em células vivas com metabolismo ativo. A formação deste produto colorido é, portanto, um marcador de viabilidade celular. No entanto, os tempos de incubação são longos (geralmente 4 horas) e o formol é insolúvel; é necessário adicionar um solubilizador antes de realizar a medição por colorimetria.

2) Compostos carregados negativamente (MTS, XTT, WST-1) que inversamente não penetram nas células. Portanto, é necessário acoplar essas moléculas a um aceitador intermediário de elétrons (PMS), capaz de penetrar nas células e transferir elétrons do NADH para o tetrazólio, que serão reduzidos à forma solúvel em formazan. Portanto, o protocolo é mais direto e mais prático do que com o MTT. O tempo de incubação deste método permanece idêntico, de 1 a 4 horas.

Produtos Promega: CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Código: G4000), CellTiter 96® AQueous One solution Cell Proliferation (Código: G3582)

 

5. Redução de resazurina

A resazurina é outra molécula que serve como um indicador redox. Tem uma cor azul da meia-noite e uma baixa fluorescência intrínseca. Depois de entrar na célula, em resposta à atividade metabólica das células vivas, a resazurina é reduzida a resorufina, que tem uma cor rosa e é fluorescente. Após um período de incubação de 1 a 4 horas, a resorufina é medida por colorimetria ou fluorimetria. Esse método barato é mais sensível que o baseado na redução do tetrazólio, mas muitos compostos podem interagir e atrapalhar a leitura..

Produto Promega: CellTiter-Blue® Cell Viability Assay (Código: G8080)

 

A principal desvantagem desses testes com base na redução de tetrazólio ou resazurina é que eles resultam do acúmulo de um produto colorido ou fluorescente. À medida que o sinal aumenta gradualmente ao longo do tempo, é impossível detectar uma diminuição na viabilidade celular durante essa longa incubação.

 

Baixe o Assay Guidance Manual (em inglês) para saber mais sobre esses ensaios de viabilidade celular.