GTPase-Glo™ Assay
Simple, Sensitive GTPase Activity Assay
- Simple add-and-read format
- Suitable for 96-, 384- and 1536-well plates
- Low background and large dynamic range
Catalog Number:
Size
Catalog Number: V7681
Catalog Number: V7682
Detecção Bioluminescente de Atividades de GTPase, GAP e GEF
O ensaio GTPase-Glo™ é um ensaio homogêneo e bioluminescente usado para medir as atividades de GTPases e suas proteínas associadas (GEFs e GAPs) in vitro. O ensaio quantifica a quantidade de GTP remanescente após uma reação de GTPase.
Com o Ensaio GTPase-Glo™, você pode medir a atividade intrínseca da GTPase, a atividade da GTPase estimulada por GAP, a atividade de GAP e a atividade de GEF. O kit contém tampões de reação otimizados, tampão GTPase/GAP e tampão GEF, para realizar reações de GTPase e GAP e reações de GEF, respectivamente.
Protocolo Fácil, "Adicionar e Ler
O Ensaio GTPase-Glo™ mede a atividade da GTPase detectando a quantidade de GTP remanescente após a hidrólise do GTP em uma reação de GTPase. Após a reação de GTPase, a adição do Reagente GTPase-Glo™ converte qualquer GTP remanescente em ATP, que é convertido em um sinal luminescente após a adição do Reagente de Detecção.
A atividade da GTPase, GAP e GEF é inversamente correlacionada à quantidade de luz produzida. Uma GTPase altamente ativa hidrolisa mais GTP, reduzindo a quantidade de ATP produzida a partir do GTP e reduzindo a saída de luz. Uma GTPase menos ativa hidrolisa menos GTP, deixando uma quantidade maior de GTP para ser convertida em ATP e produzindo mais luz.
O diagrama à esquerda mostra a GTPase nas fases ativa e inativa em relação ao GDP e ao GTP. O diagrama à direita é um esquema do protocolo do ensaio GTPase-Glo™.
Monitorar uma Variedade de Proteínas Moduladoras de GTPase (ou seja, GEFS, gapS)
Para mediar o processo de transferência entre as formas ativa e inativa, as GTPases precisam da ajuda de duas famílias de proteínas: Proteínas ativadoras de GTPase (GAPs) e fatores de troca de nucleotídeos de guanina (GEFs). Os GEFs substituem o GDP ligado à GTPase inativa por GTP, tornando a enzima ativa e transduzindo uma grande variedade de sinais celulares. Em seguida, as GTPases precisam da ajuda dos GAPs para hidrolisar o GTP e desativar a cascata de sinalização.
Estimulação da Atividade de GTPase com GEF
Reactions containing 2µM of wildtype or mutant Ras (RasG12V) plus 1µM of NF1-333 (GAP protein) in GTPase/GAP Buffer.
Reactions containing 2µM of wildtype or mutant Ran (RanE70A) plus 1µM of RanGAP (GAP protein) in GTPase/GAP Buffer.
Estimulação da Atividade GTPase por Proteínas GAP
Detecção Sensível de Enzimas Moduladoras de GTPase
O Ensaio GTPase-Glo™ detecta quantidades baixas de nanogramas de enzimas moduladoras de GTPase em uma reação química.
Avaliação das atividades GAP de NF1-333 e RanGAP com o ensaio GTPase-Glo™
Esse experimento mostra uma titulação de NF1-333 ou RanGAP na presença de uma concentração fixa da GTPase cognata (Ras ou Ran, respectivamente).
O NF1-333 ou RanGAP foi diluído em série no tampão GTPase/GAP e 5 µl foram dispensados em cada poço de uma placa de 384 poços. Cinco microlitros de solução 2X GTPase-GTP contendo 2 µM Ras ou 2 µM Ran e 10 µM GTP em tampão GTPase/GAP foram adicionados aos GAPs dispensados. As reações de GTPase foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente e, em seguida, foram adicionados 10 µl do reagente GTPase-Glo™ reconstituído. Após uma incubação de 30 minutos em temperatura ambiente, foram adicionados 20 µl de Reagente de Detecção, as reações foram incubadas por 5 minutos e a luminescência foi registrada.
Protocols
Complete Protocol
Specifications
Catalog Number:
What's in the box?
| Item | Código | Tamanho | Concentration | Available Separately |
|---|---|---|---|---|
rGTP |
P115A | 1 × 50μl | 10mM | View Product |
|
DTT |
P117A | 1 × 100μl | 100mM | View Product |
GTPase/GAP Buffer |
V763A | 1 × 5ml | ||
GEF Buffer |
V764A | 1 × 5ml | ||
GTPase-Glo™ Buffer |
V765A | 1 × 5ml | ||
GTPase-Glo™ Reagent, 500X |
V766A | 1 × 15μl | ||
Detection Reagent |
V767A | 1 × 10ml | ||
|
ADP, 10mM |
V916A | 1 × 500μl |
SDS
Search for SDSCertificado de Análise
Restrições de uso
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.Condições de armazenamento
What's in the box?
| Item | Código | Tamanho | Concentration | Available Separately |
|---|---|---|---|---|
|
rGTP |
P115B | 1 × 0.5ml | 10mM | View Product |
|
DTT |
P117C | 1 × 1.25ml | 100mM | View Product |
GTPase/GAP Buffer |
V763B | 1 × 50ml | ||
GEF Buffer |
V764B | 1 × 50ml | ||
GTPase-Glo™ Buffer |
V765B | 1 × 50ml | ||
GTPase-Glo™ Reagent, 500X |
V766B | 1 × 120μl | ||
Detection Reagent |
V767B | 1 × 100ml | ||
|
ADP, 10mM |
V916A | 1 × 500μl |
SDS
Search for SDSCertificado de Análise
Restrições de uso
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.Condições de armazenamento
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