Ensaios de Detecção de Nucleotídeos e Co-Fatores
A nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) é um importante cofator para a produção de ATP durante a fosforilação oxidativa. O fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADP) é essencial para as vias biossintéticas de criação de macromoléculas. Tanto o NAD quanto o NADP fornecem equivalentes redutores por meio da conversão entre as formas oxidadas (NAD+, NADP+) e as formas reduzidas (NADH, NADPH).
O NAD+ tem outra função como substrato nas reações de ribosilação de ADP envolvidas no reparo do DNA, na expressão gênica, na regulação de MAPK e na sinalização de Ca2+.
Oferecemos ensaios sensíveis baseados em bioluminescência para monitorar os níveis celulares de NAD ou NADPH oxidado, reduzido ou total por meio de uma reação enzimática acoplada. A reação central pode ser usada para monitorar o consumo ou a produção de NADH ou NADPH em ensaios in vitro e bioquímicos.
Ao estudar o metabolismo, o ATP é o foco. A Promega oferece os mais sensíveis ensaios bioluminescentes add-mix-measure para a medição de ATP em ensaios baseados em células.
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Introdução aos Ensaios de Detecção de Nucleotídeos e Co-Fatores
Os dinucleotídeos de nicotinamida adenina são cofatores solúveis abundantes que sofrem oxidação e redução reversíveis nas principais vias metabólicas. Eles são importantes na pesquisa sobre o câncer porque, como metabólitos, podem vincular as vias metabólicas ao controle transcricional, à epigenética e à sinalização celular à medida que as células mudam de um metabolismo normal para um metabolismo de célula cancerosa (proliferativo). Nas células, eles estão presentes em estados oxidados e reduzidos em suas formas não fosforiladas (NAD e NADH) e fosforiladas (NADP e NADPH). Esses dinucleotídeos trabalham em pares, e cada par tem funções distintas.
O NAD e o NADH são cofatores essenciais no metabolismo energético. Nas células em repouso, a proporção de NAD+/NADH é inclinada para mais NAD+. As células em proliferação tendem a ter um excesso de NADH. O NADH é gerado durante a fosforilação no nível do substrato na via glicolítica e fornece equivalentes redutores para a produção de ATP durante a fosforilação oxidativa.
O NAD é conhecido principalmente por sua função no metabolismo energético, mas também é usado por enzimas como a poli ADP-ribose polimerase (PARP) e as sirtuínas que realizam reações de ribosilação de ADP. Uma área ativa de pesquisa é a síntese de novo de NAD a partir de subprodutos de reações de ribosilação de ADP.
O NADP e o NADPH são mais notáveis por fornecerem equivalentes redutores para reações biossintéticas e regeneração de duas moléculas de GSH a partir de GSSG. A medição de NADP e NADPH é um desafio, pois esse par é 10 vezes menos abundante do que o par NAD e NADH. A função de regenerar GSH é fundamental para o controle dos níveis de ROS gerados pela fosforilação oxidativa.
Devido às diversas funções que os dinucleotídeos de nicotinamida adenina desempenham na regulação celular, na expressão gênica e nas doenças, os biólogos estão agora analisando essas moléculas como indicadores do mecanismo de ação dos medicamentos ou das toxicidades do tratamento e na pesquisa de descoberta de medicamentos.
Os pesquisadores se beneficiam de ensaios para monitorar os níveis desses nucleotídeos e cofatores em ensaios bioluminescentes sensíveis que são passíveis de formatos de triagem de alto rendimento. Os formatos de ensaio alternativos incluem ensaios colorimétricos ou fluorométricos menos sensíveis baseados em leitores de placas, que exigem processamento adicional da amostra. Técnicas de química analítica, como a espectrometria de massa, também podem ser usadas para monitorar os níveis de cofatores.
