Automatização da extração de ácidos nucleicos
A automatização da extração de ácidos nucleicos pode ser um projeto particularmente desafiante devido à diversidade de espécimes biológicos, produtos químicos de extração e tecnologias. O utilizador e os seus parceiros de automatização necessitarão de um conhecimento profundo de química, biologia e robótica.
Desenvolvimento de um fluxo de trabalho automatizado de extração de ácidos nucleicos
A extração de ácido nucleico é a base para dezenas de diferentes aplicações e análises a jusante. A automatização deste processo pode ajudar o seu laboratório a obter maiores rendimentos, melhorar a precisão e muito mais. No entanto, o desenvolvimento de um fluxo de trabalho compatível com o seu tipo de amostra e que satisfaça os seus requisitos de qualidade exigirá muito planeamento, testes e otimização. Também é necessário compreender a robótica, o manuseamento de amostras biológicas, a química de extração e a forma de avaliar o desempenho da extração.
Os recursos desta página ajudá-lo-ão a desenvolver o seu próprio fluxo de trabalho automatizado de extração de ácido nucleico. Ficará a saber mais sobre:
- Extração de ácido nucleico utilizando partículas magnéticas e robôs de manuseamento de líquidos.
- O trabalho de base necessário antes de trabalhar com um robô.
- Como construir e resolver problemas de um fluxo de trabalho automatizado de extração de ácido nucleico.
Se procura assistência para otimizar ou criar novos métodos de extração automatizados, os nossos cientistas técnicos podem ajudar.
Os fundamentos da extração automatizada de ácidos nucleicos
Como funcionam as extracções de ácido nucleico com base em esferas?
Enquanto a maioria dos métodos de bancada para extração de ácidos nucleicos utiliza métodos de coluna de centrifugação baseados em filtros, os fluxos de trabalho automatizados utilizam mais frequentemente esferas magnéticas que se ligam reversivelmente aos ácidos nucleicos. Estas esferas, também chamadas partículas magnéticas, podem ser facilmente manipuladas e controladas por um robot. No entanto, são mais difíceis de manusear do que as colunas de centrifugação e apresentam desafios únicos, incluindo uma má dispersão das esferas devido a níveis elevados de impurezas numa amostra ou à utilização de esferas mais pesadas.
Embora os reagentes específicos possam variar, as extracções baseadas em partículas magnéticas seguem os mesmos quatro passos básicos.
- Em primeiro lugar, é adicionada uma solução de lise à amostra, que quebra as células e liberta os ácidos nucleicos para a solução.
- São adicionadas partículas magnéticas revestidas com um material que permite a ligação reversível dos ácidos nucleicos.
- As partículas são lavadas, frequentemente com tampões que contêm etanol, para remover sais, detergentes e resíduos celulares remanescentes, deixando os ácidos nucleicos ligados às partículas magnéticas.
- Finalmente, adiciona-se água às partículas, re-hidratando e libertando os ácidos nucleicos das partículas magnéticas.
Esta química pode ser automatizada utilizando operações robóticas programáveis que manipulam as esferas magnéticas.
Como é que os robôs movedores de partículas e manipuladores de líquidos funcionam?
Existem dois tipos principais de robôs para a realização de extracções automatizadas de ácidos nucleicos: robôs de movimentação de partículas e robôs de manuseamento de líquidos.
Os robots de movimentação de partículas atraem esferas magnéticas para uma haste magnética. Os grânulos são movidos com as hastes para poços previamente cheios com reagentes de extração. Quando os grânulos chegam a um poço, a magnetização pára e os grânulos são libertados. A mistura dispersa os grânulos por toda a solução. Em seguida, a haste é novamente magnetizada e os grânulos são movidos para outro poço.
Em contrapartida, os manipuladores de líquidos transferem reagentes líquidos de ou para os poços. As esferas magnéticas são magneticamente imobilizadas no interior do poço durante as transferências de líquidos.
Os robots de movimentação de partículas atraem esferas magnéticas para uma haste e movem as esferas para poços pré-cheios de reagentes. Os robôs manipuladores de líquidos utilizam pipetas para transferir líquidos enquanto as esferas magnéticas são mantidas no lugar por um íman externo.
Neste guia, centramo-nos nos robôs manipuladores de líquidos, uma vez que os métodos para estas plataformas tendem a ser mais difíceis de construir, mas muitos dos princípios continuam a aplicar-se aos robôs de movimentação de partículas.
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Um robô de manuseamento de líquidos desempenha quatro funções básicas durante um fluxo de trabalho de extração automatizado:
- Movimentação de líquidos
- Magnetização
- Mistura
- Controlo da temperatura
’Terá de compreender a robótica e a química de extração baseada em esferas magnéticas antes de criar um fluxo de trabalho de extração de ácido nucleico automatizado.
Um biólogo molecular pode facilmente resolver problemas de má mistura de reagentes durante uma extração manual com uma amostra viscosa. Mas como seria isso num robô? Em contrapartida, um engenheiro pode saber como escrever um guião que programa um robô com todos os passos necessários de mistura, pipetagem e magnetização. Mas que passos podem ser optimizados para resolver o problema de uma impureza proteica? É importante ter uma equipa colaborativa de especialistas que compreendam a biologia, a química e a tecnologia necessárias para automatizar um fluxo de trabalho de extração de ácido nucleico.
Quais são os primeiros passos para automatizar a extração de ácido nucleico?
Poderá surpreendê-lo o facto de o primeiro passo para automatizar a extração de ácido nucleico não ser a programação de um robô. Em vez disso, os primeiros passos são:
- Estabelecer os requisitos e controlos para o seu fluxo de trabalho de extração, incluindo a qualidade do ácido nucleico extraído e a taxa de produção das suas amostras.
- Estabelecer um método de extração manual baseado em partículas magnéticas que cumpra ou exceda os seus padrões de qualidade.
Para os requisitos do fluxo de trabalho, em geral, é necessário
- Alta pureza (os contaminantes podem inibir as etapas a jusante, como a PCR).
- Recuperação ou rendimento aceitáveis.
- Um fluxo de trabalho que cumpra os tempos de processamento necessários.
- Volumes aceitáveis de amostras de ácido nucleico eluídas.
- Sem contaminação cruzada de amostras.
Os limites exactos para cada requisito dependerão da sua aplicação.
Eis alguns exemplos de requisitos que pode ter para o seu fluxo de trabalho de extração de ácido nucleico.
- A260/A230 > 1.8 (isento de contaminantes salinos)
- A260/A280 > 1.8 (livre de contaminantes proteicos)
- O controlo da extração atinge rendimentos aceitáveis (por exemplo, > 80%) do(s) tipo(s) de amostra(s) de interesse para servir de referência para a automatização.
- O controlo da extração atinge rendimentos aceitáveis (por exemplo, > 80%) do ácido nucleico de entrada (como ácidos nucleicos adicionados).
- Os ácidos nucleicos eluídos são funcionais para aplicações a jusante, como qPCR ou sequenciação de nova geração.
- Menos de um ciclo de diferença na amplificação PCR em comparação com um controlo.
- 50µl de ácidos nucleicos eluídos.
- Tempo de processamento do robot de 1,5h.
- Produtividade automatizada de 12-96 amostras por execução.
Antes de trabalhar com um robô, é necessário desenvolver um método de extração manual que satisfaça e exceda os seus requisitos. Uma extração automatizada pode ser mais consistente e ter um rendimento mais elevado, mas os rendimentos finais e a pureza raramente serão melhores do que os obtidos manualmente. Um método de extração manual que funcione bem será um controlo vital quando começar a otimizar um fluxo de trabalho automatizado numa plataforma robótica. Este trabalho inicial irá mostrar-lhe como a sua amostra se comporta durante o fluxo de trabalho de extração e quais os passos que também podem ser difíceis com um robot.
Um método de extração manual que funcione bem será um controlo vital quando se começar a otimizar um fluxo de trabalho automatizado numa plataforma robótica.
Se tiver dificuldade em obter rendimentos e pureza elevados de um método manual que utilize os mesmos reagentes que a automatização planeada, o método automatizado será quase de certeza pior. Existem demasiadas variáveis a controlar se tentar otimizar a química de extração e a robótica ao mesmo tempo. O seu método manual fornece um conjunto de controlos para avaliar o desempenho de um fluxo de trabalho automatizado. Ser capaz de identificar rapidamente os pontos de falha de um fluxo de trabalho automatizado pode poupar-lhe dias ou semanas de trabalho.
Para começar, irá otimizar manualmente os passos de uma extração baseada em partículas magnéticas utilizando os mesmos reagentes, tipo de amostra e kit de extração que pretende utilizar para o fluxo de trabalho automatizado. Utilize pipetas e um íman para manipular os líquidos e as partículas magnéticas.
Embora tenha de desenvolver o seu método manual utilizando o tipo de amostra pretendido, existem outros tipos de amostras mais simples que podem ajudá-lo a resolver determinados passos da sua extração. Começar com ADN purificado, como uma escada de ADN ou ADN genómico purificado, pode revelar se o seu método conduz a rendimentos inadequados ou introduz impurezas sem as complexidades de uma matriz de amostra e detritos celulares. As culturas de células, como as células HeLa, também podem ser um tipo de amostra de teste valioso, porque é possível controlar o número de células - e de ácido nucleico - adicionadas. Estes modelos são úteis, mas não deve otimizar todo o seu método com eles. Execute-os em paralelo ou conforme necessário para solucionar problemas de uma etapa específica. Se estes sistemas modelo simples não estiverem a cumprir os seus requisitos, então uma matriz complexa como o sangue total irá falhar.
Pode ser útil ver o desempenho da sua extração manual optimizada de ácidos nucleicos com tipos de amostras mais controlados, tais como amostras de ADN e culturas de células padrão, mas é essencial criar um método que funcione para o tipo de amostra pretendido.
O que deve verificar ao otimizar um método de extração manual?
Os ácidos nucleicos ligaram-se completamente à partícula magnética?
Os ácidos nucleicos precisam de tempo suficiente para "chocarem" com as partículas magnéticas. Para se certificar de que tem tempo e intensidade de mistura suficientes no seu método manual, normalmente é suficiente misturar a suspensão de esferas pipetando algumas vezes e misturando com um rotador ou vortex durante cerca de 10 minutos. O fabricante do kit de extração pode também sugerir tempos e métodos de mistura. Verificar visualmente para garantir que as esferas permanecem suspensas.
Os grânulos foram suficientemente lavados?
As pérolas magnéticas tendem a agregar-se quando estão presentes materiais biológicos. A menos que as esferas sejam totalmente ressuspensas e dispersas durante os passos de lavagem, as proteínas e outros contaminantes ficarão presos nos agregados. Utilize a pipetagem para ressuspender as esferas durante os passos de lavagem. Observe para se certificar de que os grânulos se dispersam completamente. Nessa altura, a lavagem deve estar concluída.
Certifique-se de que muda de tubo após os passos de lavagem. Os sais dos reagentes de extração podem ficar presos na tampa e nos bordos e reduzir a pureza da amostra. Isto não será um problema quando passar para um método automatizado.
As pérolas foram secas corretamente?
Se os seus grânulos não estiverem suficientemente secos, o álcool residual dos passos de lavagem não será removido. Os reagentes de álcool podem reduzir a recuperação de ácidos nucleicos e contaminar o eluato. No entanto, se as esferas forem secas durante demasiado tempo, os ácidos nucleicos podem ser difíceis de reidratar e eluir. A recuperação será muito baixa.
As diferentes partículas magnéticas podem ter propriedades únicas, pelo que deve seguir os tempos de secagem recomendados pelo fabricante das partículas. Se as instruções não forem claras, então a secagem à temperatura ambiente durante aproximadamente 20-30 minutos é um ótimo ponto de partida.
Como é que as operações robotizadas podem afetar a qualidade da extração?
Quando tiver um método manual para extração de ácido nucleico com base em esferas magnéticas que satisfaça consistentemente os seus requisitos, está pronto para trabalhar com uma plataforma robótica.
Movimentação de líquidos
Nem todos os líquidos têm a mesma densidade ou viscosidade. Se não definir estes atributos para a plataforma robótica, o seu robot pode pingar durante as transferências ou não transferir os volumes correctos de líquido. Mesmo que o volume de líquido transferido pelo robô pareça correto, pode haver discrepâncias. Pode atenuar estes problemas definindo as classes de líquidos com que a plataforma irá lidar.
Se estiver a utilizar um kit de extração, pode pedir ao fabricante as classes de líquidos do kit. O fabricante do robot de manuseamento de líquidos também pode dar sugestões. O robô também pode ter classes de líquidos pré-programadas como ponto de partida para si.
Depois de programar as classes de líquido para extrair e dispensar os volumes correctos sem pingar, existem outras formas de melhorar o movimento do líquido.
- Introduzir um pequeno volume de ar na pipeta do manipulador antes de retirar os líquidos para ajudar a dispensar todo o volume de líquido.
- Depois de carregar a pipeta com o líquido, puxar algum ar para evitar pingos.
- O humedecimento prévio das pipetas, pipetando o líquido duas a três vezes antes de retirar o volume desejado, pode melhorar a precisão. Isto é especialmente verdadeiro para líquidos viscosos.
- Se estiver a trabalhar com líquidos viscosos, pode introduzir mais reagente na pipeta para garantir que é dispensado o volume correto.
- Para líquidos difíceis de pipetar, pode mergulhar a ponta da pipeta na camada de líquido durante a dispensação. Esta ponta não deve ser utilizada para dispensas repetidas.
Magnetização
Existem dois tipos comuns de suportes magnéticos nos robots de manuseamento de líquidos. Os ímanes em anel atraem os grânulos magnéticos para uma faixa horizontal ao longo da parede do poço de amostra. Estes são os melhores se’estiver a trabalhar com volumes de eluição baixos. O robot pode remover quase todo o sobrenadante do poço sem remover os grânulos. Os pós-ímans atraem os grânulos para a parede lateral do poço numa linha vertical. Pode ser mais fácil automatizar um sistema que utilize pós-ímans porque os grânulos migram para longe do fundo do poço e para fora do percurso da pipeta. No entanto, são necessários volumes de eluição maiores.
Os robots de manuseamento de líquidos concebidos para trabalhar com sistemas baseados em esferas magnéticas podem utilizar diferentes tipos de suportes magnéticos e, dependendo do seu sistema, pode haver vantagens em utilizar um tipo em detrimento de outro.
Se o robot não imobilizar totalmente as esferas magnéticas, algumas podem perder-se. Isto reduzirá o rendimento dos ácidos nucleicos. O ajuste do tempo de magnetização pode resolver este problema. Normalmente, é suficiente magnetizar durante um a três minutos. Inspecionar visualmente a amostra para garantir que os grânulos estão totalmente recolhidos no íman.
Mistura
É na mistura que ocorre a maioria dos problemas nas extracções automatizadas de ácidos nucleicos. Os passos de ligação, lavagem e eluição requerem uma mistura eficiente. Uma mistura deficiente pode levar a baixos rendimentos e pureza de ácido nucleico. Os principais factores que afectam a mistura são a viscosidade da solução, a miscibilidade da solução, o tamanho das partículas magnéticas e a densidade das partículas. Por exemplo, alguns líquidos adicionados durante o fluxo de trabalho de extração podem não ser muito miscíveis ou são demasiado viscosos e os componentes não se misturam bem.
Os robots de manuseamento de líquidos podem utilizar um agitador ou uma pipeta para misturar.
No caso de um agitador, certifique-se de que se forma um vórtice completo e que as partículas magnéticas se dispersam e suspendem completamente. Se for difícil de ver, gravar um vídeo que possa ser reproduzido em câmara lenta pode ajudar. Utilizar a velocidade máxima do agitador nem sempre é uma boa solução para uma mistura deficiente - pode apenas salpicar a amostra.
A mistura com pipeta pode misturar bem soluções viscosas, mas normalmente só é viável para plataformas de baixo rendimento.
A mistura com pipetas demora muito tempo. Para um robô com uma pipeta de 8 canais, são necessárias duas horas para misturar 96 amostras para um passo de ligação de 10 minutos. Para sistemas que requerem a mistura de pipetas, deve considerar-se a utilização de um robô de movimentação de partículas ou de um robô de manuseamento de líquidos com uma pipeta de 96 canais.
Temperatura
Finalmente, há o controlo da temperatura. A aplicação de temperaturas incorrectas pode levar a rendimentos fracos e a uma baixa qualidade do ácido nucleico por várias razões:
- As enzimas utilizadas na extração requerem temperaturas específicas para uma atividade máxima.
- Temperaturas elevadas durante a fase de secagem ou uma secagem demasiado longa podem secar demasiado as esferas magnéticas.
- As baixas temperaturas durante a fase de secagem podem provocar a libertação de impurezas.
Utilize um termómetro para testar se o robô atinge as temperaturas programadas. Siga as temperaturas e os tempos de secagem recomendados para o seu kit de extração.
Como otimizar e resolver problemas de um método automatizado?
Existem seis passos fundamentais para a maioria dos fluxos de trabalho automatizados de extração de ácido nucleico utilizando partículas magnéticas e existem muitas variáveis a otimizar nestes passos. No entanto, pode desenvolver cada passo gradualmente utilizando o seu método de extração manual como controlo.
Optimize cada passo por ordem sequencial. Após cada passo, ou série de passos, com o robot, termine a extração manualmente. Isto permite-lhe avaliar a qualidade do passo automatizado em comparação com o controlo manual. Pode poupar tempo se inspecionar visualmente se determinados critérios são cumpridos em cada passo. Por exemplo, certifique-se de que as partículas estão suspensas durante uma ligação ou lavagem antes de avançar. Quando o rendimento, a pureza ou outros requisitos são inferiores aos que obteria com o método manual, deve otimizar o passo automatizado mais recente. Se a qualidade for aceitável, pode avançar para o passo seguinte no fluxo de trabalho automatizado.
Ao otimizar, tenha sempre em mente os requisitos do seu processo. É’fácil otimizar em demasia passos que não influenciam grandemente o resultado do fluxo de trabalho de extração ou a sua aplicação a jusante. Mas as perdas de rendimento também se acumulam em várias etapas. Terá de’decidir qual o equilíbrio adequado. Por exemplo, considere a otimização do manuseamento de líquidos para amostras de sangue total. Uma vez que as amostras são tipicamente viscosas, um erro de 5–10r nos volumes de pipetagem pode ser um compromisso de desempenho aceitável. Mas um gotejamento que contamine outras amostras não o é.
Eis as seis etapas principais da automatização e algumas sugestões que o ajudarão a enfrentar os desafios mais comuns.
Lise e digestão
Se estiver a utilizar um kit de extração, siga os passos recomendados. A ordem de adição pode afetar seriamente o desempenho da extração. Por exemplo, só deve adicionar proteinase à sua amostra ou a uma mistura da sua amostra e reagentes de digestão. A adição de proteinase diretamente aos reagentes de digestão reduzirá a eficiência do passo de lise e digestão. A temperatura também é crítica. Mantenha-se atento às suas amostras. Uma turvação ou viscosidade inesperada em comparação com o seu controlo manual pode significar que a temperatura é demasiado elevada.
Ligar
Este passo tem tudo a ver com a mistura! Certifique-se de que as partículas estão completa e uniformemente suspensas em toda a amostra. Se estiver a utilizar um agitador, observe e certifique-se de que se forma um vórtice completo. Durante este passo, os volumes são frequentemente grandes e não é possível utilizar as velocidades máximas de mistura do vórtice. Os salpicos durante o passo de aglutinação são a segunda causa mais comum de contaminação cruzada poço a poço (depois do gotejamento durante as transferências de líquidos). Uma placa de poço padrão de 2 ml pode normalmente manusear 1,0 a 1,2 ml de líquido antes que a contaminação cruzada durante a mistura se torne um problema.
Para líquidos viscosos como o sangue, pode ser difícil ressuspender as partículas depois de assentarem. Iniciar a mistura antes de adicionar as partículas magnéticas pode manter as partículas suspensas.
Também pode misturar por pipetagem se os seus requisitos de rendimento forem baixos ou se a sua configuração robótica o permitir.
Magnetização
Se observar rendimentos inferiores aos esperados, a causa pode ser a magnetização insuficiente dos grânulos.
A imobilização dos grânulos magnéticos é controlada por três parâmetros: a posição dos ímanes, a quantidade de campo magnético aplicado e a quantidade de partículas magnéticas. Observe os grânulos durante este passo. Certifique-se de que estão totalmente recolhidas. Magnetizar o poste durante um a três minutos é normalmente suficiente. Se estiver a utilizar um íman em anel, certifique-se de que existe um espaço livre no centro do poço para a pipeta. Se não houver um caminho livre para a pipeta até ao fundo do poço, reduzir o número de esferas na extração.
Lavagem
Se os valores de A260/A230 ou A260/A280 da sua amostra diminuírem durante a otimização da fase de lavagem, é provável que as impurezas’não tenham sido totalmente lavadas.
O seu método envolverá provavelmente várias lavagens. A primeira é a mais difícil e mais importante de otimizar. Nesta altura, existem muitas proteínas na amostra. Essas proteínas podem fazer com que os grânulos se agreguem e prendam as impurezas. As partículas magnéticas devem ser totalmente ressuspensas para libertar e lavar estas impurezas. Uma boa mistura é crucial.
Tentar aumentar a velocidade do agitador para melhorar a suspensão das esferas durante a primeira lavagem. Os volumes devem ser baixos nesta fase, pelo que o risco de salpicos é reduzido. Se for necessário misturar por pipetagem, considere a utilização de um robô movedor de partículas ou de uma pipeta de 96 canais na plataforma ou o seu rendimento diminuirá drasticamente. Se uma mistura mais rápida não’melhorar a suspensão das esferas, experimente lavar a amostra com água ou tampão TE e misturar vigorosamente. Isto elui os ácidos nucleicos das esferas e quebra os agregados. Volte a ligar os ácidos nucleicos adicionando tampão de ligação nas proporções exactas utilizadas na etapa de ligação.
Se as esferas estiverem totalmente suspensas durante o passo de lavagem e, mesmo assim, a pureza for baixa, pode haver um problema com o manuseamento do líquido no robot. Se o robot não absorver totalmente o sobrenadante durante os passos de lavagem, as impurezas podem persistir. É possível ajustar os volumes de transferência de líquido. Também pode adicionar outra lavagem para diluir os contaminantes persistentes. Utilize uma solução polar, não viscosa, como 80–95thanol ou a solução utilizada para a lavagem final recomendada.
Secagem
Seguir as instruções do fabricante do kit ou o protocolo do manual para a secagem. A secagem à temperatura ambiente é mais lenta mas tende a dar resultados consistentes. As temperaturas mais elevadas aceleram a secagem, mas podem secar demasiado as partículas e dar rendimentos mais baixos até serem optimizadas. Para maximizar a velocidade de processamento, é provável que seja necessário otimizar a temperatura e o tempo deste passo.
Eluição
A eluição é apenas afetada por alguns parâmetros - mistura e temperatura. Em geral, a eluição aquecida não é necessária, mas pode melhorar os rendimentos. O elemento mais importante nesta fase é a mistura efectiva durante, pelo menos, um a três minutos.
Folha de cálculo para automatizar o seu laboratório
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