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As doenças do fígado, incluindo a doença hepática não alcoólica (NAFLD) e a esteato-hepatite não alcoólica (NASH), são doenças crónicas sem tratamento eficaz. Para apoiar os investigadores que estudam as doenças do fígado, oferecemos métodos fáceis e fiáveis para medir o metabolismo celular, o stress oxidativo e a inflamação. Os nossos ensaios utilizam tecnologia luminescente para uma deteção sensível, e os protocolos são rápidos e simples.
Explore os produtos e recursos abaixo para ver como podemos apoiar a sua investigação.
O que é a doença hepática gorda não alcoólica (NAFLD) e a esteato-hepatite não alcoólica (NASH)?
A doença hepática gorda não alcoólica (DHGNA) é um termo genérico para descrever um espetro de doenças em que há uma acumulação excessiva de gordura (incluindo triglicéridos, ácidos gordos livres e colesterol) no fígado. Os dois tipos de DHGNA são o fígado gordo não alcoólico (FHNA), em que há pouca ou nenhuma inflamação no fígado, e a esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), em que a acumulação de gordura é acompanhada de inflamação e lesão hepática. Se não for diagnosticada, a NAFLD pode eventualmente progredir para fibrose hepática, cirrose e cancro primário do fígado.
A NAFLD é muito comum, afectando >25% dos adultos em todo o mundo. No entanto, não existem atualmente tratamentos medicamentosos aprovados pela FDA para esta doença. A doença é complexa, com muitos factores ambientais e genéticos que contribuem para a sua origem e progressão. Para além da complexidade, a patologia da doença é sistémica, uma vez que o fígado é o centro de muitas vias metabólicas. Os ensaios para monitorizar as vias metabólicas e a saúde das células são essenciais para fazer avançar a nossa compreensão da NAFLD e para desenvolver tratamentos para a doença.
Os ensaios da Promega oferecem uma série de vantagens para a investigação de doenças hepáticas:
- A ampla compatibilidade de amostras permite a continuidade entre projectos - desde modelos celulares simples a organóides 3D complexos e amostras de tecidos.
- A deteção luminescente é sensível, permitindo uma monitorização precisa das alterações biológicas.
- O amplo intervalo linear capta alterações de 1.000 vezes na concentração de metabolitos sem qualquer diluição da amostra.
- A miniaturização permite o rastreio rápido de inibidores em formatos de elevado rendimento.
Como medir a homeostase dos triglicéridos e a esteatose
A patologia caraterística da NAFLD é a acumulação de triglicéridos nos hepatócitos, também designada por esteatose. Os triglicéridos em excesso provêm de duas fontes principais. Em primeiro lugar, os ácidos gordos livres (AGL) dos lípidos da dieta e dos tecidos adiposos são convertidos em triglicéridos através da lipogénese. Em segundo lugar, a resistência à insulina promove a lipogénese de novo, em que os triglicéridos são sintetizados a partir de hidratos de carbono.
Pode medir facilmente a esteatose e a lipogénese com o Triglyceride-Glo™ Assay. Pode ser utilizado com diversos tipos de amostras, incluindo células lisadas, meio de cultura, homogenatos de tecidos, soro e fracções de lipoproteínas. O protocolo simples, sem lavagem, utiliza uma deteção bioluminescente sensível, fornecendo resultados superiores em comparação com ensaios baseados em coloração, colorimétricos ou fluorescentes. Em vez de uma extração orgânica complicada, os ensaios utilizam um passo rápido de lise com detergente para preparar amostras de lípidos. Do mesmo modo, os Glycerol-Glo™ Assay podem ser utilizados para medir a lipólise.
Os ácidos gordos e as lipoproteínas ligados à BSA estimulam a acumulação intracelular de triglicéridos nos hepatócitos através da lipogénese. Aqui, utilizámos o ensaio Triglyceride-Glo™ para monitorizar o conteúdo de triglicéridos de microtecidos 3D do fígado humano em várias condições de tratamento e ao longo do tempo. Os resultados demonstram que o ensaio Triglyceride-Glo™ pode ser utilizado para monitorizar a progressão da esteatose em modelos celulares.
Níveis de triglicéridos em microtecidos hepáticos humanos. Os microtecidos hepáticos humanos 3D InSight™ (InSphero) foram incubados durante 3 e 10 dias em meio isento de soro contendo níveis fisiológicos (LG/LI) ou suprafisiológicos (LG/HI) de glicose e insulina e suplementação com ácidos gordos livres ligados a BSA (FFA) ou fração plasmática de lipoproteínas de baixa densidade (LDL). Os microtecidos foram lavados duas vezes em PBS e testados quanto ao teor de glicerol total de acordo com o protocolo Triglyceride-Glo™. Os valores foram representados como concentração de triglicéridos por microtecido (MT). Os dados foram generosamente fornecidos pela InSphero, AG, Zurique, Suíça.
Estudo em destaque: Avaliação da toxicidade induzida por medicamentos em modelos celulares de NASH
Kermanizadeh et al. demonstraram neste estudo que a doença pré-existente é vital para a intensificação das lesões hepáticas induzidas por xenobióticos. Utilizaram o Triglyceride-Glo™ Assay para monitorizar a acumulação de lípidos em microtecidos de fígado humano em 3D, juntamente com o CellTiter-Glo® 2.0 para monitorizar a viabilidade.
Como medir o metabolismo da glucose
Nos hepatócitos do fígado gordo, os estudos mostram alterações no metabolismo da glicose, incluindo aumento da glicólise, produção de lactato e gluconeogénese. A resistência à insulina hepática na NAFLD contribui para esta desregulação. Oferecemos um conjunto de ensaios que lhe permitem detetar alterações no metabolismo da glucose com elevada sensibilidade.
- A gluconeogénese, a síntese de novas moléculas de glicose, pode ser monitorizada utilizando o Glucose-Glo™ Assay.
- A glicólise, a decomposição da glicose para obtenção de energia, pode ser medida utilizando o Glucose-Glo™ e/ou Lactate-Glo™ Ensaios.
- A glicogénese e a glicogenólise, a síntese e a degradação do glicogénio, podem ser monitorizadas utilizando os ensaios Glycogen-Glo™ Assay.
- A taxa de absorção de glucose pode ser medida utilizando o ensaio Glucose Uptake-Glo™ Assay.
Estudo em destaque: Compreender o efeito anticancerígeno da metformina
Cai et al. descobriram o efeito benéfico da metformina na redução da quimio-resistência nas células HepG2, o que poderia ajudar a melhorar a quimioterapia dos cancros do fígado. Utilizaram uma série de ensaios da Promega (Glucose Uptake-Glo™, Glucose-Glo™, Lactate-Glo™ e NADP/NADPH-Glo™ ) para medir a glicólise nas células de carcinoma hepatocelular HepG2.
Pôster: Ensaios bioluminescentes para investigar a ação da insulina e a esteatose
Ver dados sobre como os ensaios bioluminescentes podem ser utilizados para medir a insulina, o glucagon, a lipólise e a absorção de glucose.
Como medir o colesterol e as lipoproteínas
A NAFLD está associada a um aumento do colesterol hepático e a alterações na produção de lipoproteínas. O Cholesterol/Cholesterol Ester-Glo™ Assay pode ser utilizado para quantificar os níveis de colesterol total, de colesterol livre e de ésteres de colesterol. O protocolo simples é compatível com lisados de células, tecidos, meios, amostras de soro e lipoproteínas.
Quando o fígado está sobrecarregado com AGL, as lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) são utilizadas para exportar os AGL para o tecido adiposo. Por conseguinte, os doentes com NAFLD apresentam um aumento das lipoproteínas de baixa densidade (LDL e VLDL) e uma diminuição das lipoproteínas de alta densidade (HDL) no soro. Aqui, utilizamos o ensaio Cholesterol/Cholesterol Ester-Glo™ para medir o teor de colesterol de amostras de lipoproteínas humanas.
As lipoproteínas humanas de alta densidade e de baixa densidade adquiridas foram analisadas quanto ao colesterol total (amostras de esterase) e ao colesterol livre. As concentrações foram calculadas utilizando um padrão de colesterol de 40μM. Os valores da unidade de luz relativa (RLU) (em milhões) estão indicados no topo de cada barra.
Como medir o stress oxidativo e a morte celular
O stress oxidativo é um dos principais factores que contribuem para a progressão da NAFLD. A esteatose hepática provoca disfunção mitocondrial, stress do sistema nervoso central e lipotoxicidade, que contribuem para a produção excessiva de espécies reactivas de oxigénio (ROS). A acumulação de ERO é prejudicial, causando lesões celulares, morte e fibrose hepática. A acumulação excessiva de ROS acaba por conduzir à morte celular, outro processo fundamental envolvido na patogénese da NAFLD/NASH. O ROS-Glo™ H2O2 Assay pode ser utilizado para medir o stress oxidativo nas células. Utiliza uma deteção luminescente sensível para medir o H2O2 com um protocolo rápido e sem lavagem.
Aqui, mostramos a deteção paralela do stress oxidativo e da morte celular em células HepG2 através da multiplexagem de ROS-Glo™ com o Ensaio de Citotoxicidade Verde CellTox™.
As células HepG2 foram tratadas com compostos geradores de ROS (menadiona ou pirogalol) ou com um reagente indutor de citotoxicidade (digitonina) e incubadas a 37°C durante 2 horas. CellTox™ Green Dye (corante de ligação ao ADN impermeável à membrana como indicador de citotoxicidade) e H₂O₂ Substrate foram adicionados no momento da dosagem. Após a incubação, a fluorescência do corante verde CellTox™ foi medida, seguida da adição da solução de deteção ROS-Glo™. O sinal de luminescência do ensaio ROS-Glo™ foi medido após 20 minutos de incubação.
Como medir as citocinas inflamatórias
O stress oxidativo promove a inflamação crónica no fígado, incluindo a libertação de citocinas pró-inflamatórias. Tradicionalmente, as citocinas são medidas por ELISA, o que é frequentemente lento e requer várias etapas de lavagem. Oferecemos uma alternativa ELISA: Lumit™ Immunoassaysque são rápidos e fáceis, sem etapas de lavagem. Podem ser realizados diretamente no poço com células para detetar a libertação de citocinas, incluindo TNF-a, IL-1b, IL-6, HMGB1 e muitas outras moléculas de interesse.
Como utilizar modelos celulares 3D na investigação do fígado
Para compreender a complexa fisiopatologia da NAFLD, os investigadores estão a recorrer a modelos celulares 3D mais relevantes do ponto de vista fisiológico, tais como esferóides e microtecidos hepáticos. Interessado em implementar os ensaios da Promega em modelos de fígado 3D? Veja exemplos nestes webinars:
Webinar: Modelos de Fígado e Metabolismo Lipídico
Saiba como os modelos 3D de fígado e os ensaios de metabolismo podem ser utilizados para estudar a NASH e a NAFLD.
Webinar: Esferóides de fígado 3D e ferramentas para estudos metabólicos
Saiba como os modelos de fígado 3D e os ensaios de metabolismo são utilizados para a descoberta de medicamentos e investigação hepática de elevado rendimento.