Análise de Ácidos Nucleicos

A purificação, a quantificação e a amplificação de DNA e RNA são métodos comuns usados em muitos procedimentos laboratoriais em uma ampla variedade de aplicações. A extração de ácidos nucleicos de alta qualidade de culturas celulares, tecidos animais ou vegetais, bactérias, fluidos corporais e outros tipos de amostras é uma primeira etapa essencial na maioria dos experimentos de análise genômica. Se a qualidade do DNA extraído for ruim, todas as etapas posteriores podem ser comprometidas.

Durante a extração e a purificação de ácidos nucleicos, as amostras passam por um conjunto comum de manipulações: lise celular, limpeza, ligação do ácido nucleico, lavagem e eluição do DNA ou RNA purificado. A pureza e o rendimento do ácido nucleico extraído são considerações importantes para o desempenho ideal em aplicações subsequentes, como PCR e sequenciamento.

Os métodos de purificação de ácidos nucleicos podem ser projetados para isolar DNA ou RNA de uma ampla variedade de amostras, ou podem ser específicos para um tipo de amostra individual. A maioria dos kits de purificação de DNA pode lidar com vários tipos de amostras com pequenas variações de protocolo para garantir a lise completa do material inicial. Kits de purificação especializados podem ser necessários para tipos de amostras mais desafiadoras que contenham DNA degradado ou que tenham baixa concentração do ácido nucleico alvo. Os tipos de amostras desafiadoras incluem amostras de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE), plasma ou soro contendo DNA livre de células circulantes (ccfDNA), amostras forenses ou qualquer fonte em que a quantidade da amostra seja limitante.

Depois que o ácido nucleico é purificado, a maioria dos ensaios subsequentes exige a quantificação do DNA ou RNA antes de começar. Os métodos de quantificação do ácido nucleico incluem a medição de corantes fluorescentes de ligação ao DNA ou RNA, a medição da absorbância no comprimento de onda de 260 nm e a qPCR. A pureza do ácido nucleico também fornece um ponto de decisão para prosseguir ou não com os ensaios subsequentes com base nas proporções de 260/230 nm ou 260/280 nm.

A PCR quantitativa em tempo real, ou qPCR, é uma ferramenta padrão de análise de ácidos nucleicos usada para detecção e quantificação da expressão gênica e para detecção de sequências específicas de DNA, inclusive mutações. A PCR convencional (endpoint) e a RT-PCR são usadas para detectar e amplificar sequências de DNA específicas para manipulação posterior, incluindo análise por sequenciamento.

Os métodos de clonagem, incluindo digestão de restrição, subclonagem, clonagem por PCR e transformação de células bacterianas, também são amplamente usados nos laboratórios de biologia molecular. Esses métodos clássicos de manipulação genética de ácidos nucleicos continuam sendo uma ferramenta importante para a análise genômica.

Os recursos abaixo fornecem informações detalhadas sobre métodos de análise de ácidos nucleicos e links para produtos para cada aplicação.